和PCR比起來(lái)，qPCR不用跑膠，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增狀況，操作更為便捷。下面以德國(guó)MB Venor®GeM支原體檢測(cè)試劑盒（qPCR一步法）（Venor®GeM qOneStep）為例，略述檢測(cè)原理和過(guò)程。

   該試劑盒包括4管試劑，其中2管分別為緩沖液和PCR水，另2管為主要試劑。1管即mix，含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標(biāo)記的探針和內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照。另1管為陽(yáng)性對(duì)照，均為凍干粉。

它通過(guò)擴(kuò)增高度保守的rRNA操縱子，或者更準(zhǔn)確地說(shuō)，擴(kuò)增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū)，可以特異性地檢測(cè)支原體。在520nm（FAMTM通道）檢測(cè)支原體特異性擴(kuò)增片段。在610nm（HEXTM通道）檢測(cè)內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照的擴(kuò)增。它能特異性檢測(cè)所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì)被擴(kuò)增。通過(guò)內(nèi)部對(duì)照，可檢測(cè)PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。檢測(cè)程序可在3小時(shí)內(nèi)完成。

在檢測(cè)前，樣本需要一定的制備。具體是將100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1.5 ml反應(yīng)管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°C下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品（15秒）以沉淀任何細(xì)胞碎片。然后可直接取2μl上清液進(jìn)行qPCR。

qPCR反應(yīng)體系一共是25ul，其中樣本2ul，其余是master mix。注意設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照（無(wú)模板對(duì)照）。

如果檢測(cè)的Ct<40，則表明PCR結(jié)果陽(yáng)性。如果檢測(cè)的Ct≥40，則PCR反應(yīng)結(jié)果為陰性。如果FAM陽(yáng)性，則支原體陽(yáng)性。如果FAM陰性，HEX也陰性，表明PCR擴(kuò)增出了問(wèn)題，需要重做。如果FAM陰性，HEX陽(yáng)性，表明支原體確實(shí)陰性。

PCR擴(kuò)增出了問(wèn)題主要原因?yàn)镻CR反應(yīng)被抑制了，可能需要考慮做DNA抽提。

在qPCR反應(yīng)中，引物和探針的設(shè)計(jì)尤為重要，它既需要覆蓋大多數(shù)支原體，又需要不與細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然，Taq酶的性能也很重要，因?yàn)镈NA的擴(kuò)增終依賴(lài)于酶的活性和擴(kuò)增的速度。從這個(gè)角度說(shuō)，一個(gè)好的qPCR試劑盒是各個(gè)因素共同作用的結(jié)果。