上周我們一起討論了基于Venor®Gem qEP試劑盒的支原體qPCR經(jīng)典檢測(cè)法，也是目前使用比較廣泛的方法之一。

當(dāng)然啦，關(guān)于支原體的檢測(cè)，方法眾多。今天我們就來了解一下，操作相對(duì)更簡單的“一步法"。該方法會(huì)用到Minerva Biolabs公司的另一種試劑盒——VenorGeM® OneStep，它與上周介紹的經(jīng)典法試劑盒類似，都是利用了熒光定量PCR的基本原理。

（前情提要在這里，戳戳下方圖片傳送到經(jīng)典法支原體檢測(cè)試劑盒詳解）

不同的是，“一步法"試劑盒中，直接將內(nèi)控添加到預(yù)混液中，使用起來更加方便、節(jié)省時(shí)間。

下面我們就來詳細(xì)介紹一下VenorGeM® OneStep支原體檢測(cè)試劑盒。??

使用方法

步驟

與經(jīng)典法大致相同：

樣品處理?試劑制備?體系建立?啟動(dòng)PCR反應(yīng)?結(jié)果判定

樣品處理：

取100μl左右的細(xì)胞上清液

95℃孵育后離心，取適量用于后續(xù)qPCR。

細(xì)胞培養(yǎng)樣品易含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。

試劑制備：

將緩沖液、預(yù)混液、陽性對(duì)照等試劑按照說明書要求，該離心的離心、該混合的混合，處理好后扣緊蓋子備用。

PCR體系建立：

在PCR管中，根據(jù)需要，加入樣品、陽性對(duì)照、新鮮培養(yǎng)基（陰性對(duì)照），并且設(shè)置好重復(fù)孔，蓋好蓋子，震蕩混勻。

啟動(dòng)PCR反應(yīng)：

按照所需參數(shù)，設(shè)置好PCR儀，啟動(dòng)程序（具體參數(shù)詳見產(chǎn)品使用說明或是締一生物網(wǎng)站，點(diǎn)擊下方閱讀原文即可）。

FAM通道：檢測(cè)支原體熒光信號(hào)。

HEX通道：檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)

支原體DNA和內(nèi)控DNA，存在信號(hào)之間的競爭性抑制

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高

檢測(cè)內(nèi)控對(duì)照的HEX信號(hào)通道信號(hào)越低。

定量需要基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。

小結(jié)：

總的來說，一步法試劑盒是經(jīng)典版試劑盒的升級(jí)版。

在以下幾個(gè)方面都是相同的：

①都具有高特異性：一次即可涵蓋所有常見易感染細(xì)胞的支原體物種（包括歐洲藥典規(guī)定的9種支原體）。與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

②都具有高靈敏度：最高檢測(cè)限可達(dá)到10CFU/ml。

③都具有相應(yīng)配套的支原體基因組DNA和細(xì)菌基因組DNA，便于特異性驗(yàn)證。

④都有相應(yīng)配套的支原體絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)品，便于最后定量檢測(cè)。

不同之處在于，一步法試劑盒省去了配置內(nèi)控對(duì)照的環(huán)節(jié)，為實(shí)驗(yàn)人員節(jié)省了寶貴時(shí)間，但相應(yīng)的，價(jià)格也會(huì)比經(jīng)典法試劑盒高出一部分。